Determinacion de actividad enzimatica

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA E INACTIVACION DE PEROXIDASA EN HOJA DE PALMA

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANMDER
LABORATORIO DE BIOQUIMICA

JUNIO, 2008

Leonel Villarreal Juliana Ulloa Fernanda Delgado

RESUMEN
En la practica se determina la actividad enzimática de la peroxidasa extraída de hojas de palma y su estabilidad frente a condiciones extremas detemperatura, utilizando como sustrato peróxido de hidrogeno. El oxigeno liberado en la reacción, oxida al guayacol, un cromógeno utilizado para la cuantificación de la actividad por métodos espectrofotométricos.

INTRODUCCION
En Bioquímica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible (si bien no puedenhacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable). En estas reacciones, las moléculas sobre las que actúa la enzima en el comienzo del proceso son llamadas sustratos, y estas los convierten en diferentes moléculas, los productos.
Existen diversos métodos para medir la velocidad de una reacción enzimática. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte delsustrato o del producto (según la concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas,por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimática.

Algunos factores que pueden modificar la actividad enzimática son el pH, la temperatura y la concentración salina. Estos factores favorecen la desnaturalización, proceso en el cual se da un cambio estructural de las proteínas o ácidosnucléicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas.
Así una proteína desnaturalizada pierde su estructura tridimensional y por tanto su función biológica.

MATERIALES

Morteros de porcelana
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Centrifugadora
Papel de filtro (franja negra)
Embudo de vidrio
Tubos de ensayo
Vasos deprecipitado
Espectrofotómetro

REACTIVOS

Solución extractora
Solución buffer fosfato 60 mM Y NaCl 0,1M de pH 7.0
Hojas de palma
Guayacol
Buffer fosfato 10 mM de pH 6,0
Solución de sustratos: 10 μL de peróxido de hidrogeno (30%) y 40 μL de guayacol en 20mL de buffer de fosfato de pH 6.0

METODOLOGIA
Se picaron 6 g de hoja de palma, se trituró en un mortero adicionando 60 mL desolución extractora en el transcurso del proceso y se dejó reposar la mezcla por 20 minutos. La fase liquida de la mezcla se transvasó a tubos de ensayo y se centrifugó por 15 minutos a 4000 rmp, posteriormente se filtró el liquido sobrenadante para remover el bagazo, utilizando papel de filtro como material filtrante, el filtrado (extracto) se depositó nuevamente en tubos de ensayo para centrifugarpor 10 minutos a 4000 rmp.
Se dividió el extracto en dos porciones; una porción se tomo para preparar soluciones de extracto diluidas en solución buffer de fosfato en proporción 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100.
A cada dilución se le adiciono 3 mL de solución de sustratos en una celda, agitándola e introduciéndola rápidamente en el espectrofotómetro. Se midió la absorbancia de la solucióncada 10 segundos a una longitud de onda de 470 nm. Este proceso se repitió con todas las diluciones.
Y la otra porción se tomo para preparar una disolución 1:2. se somete la disolución a una temperatura de 84 °c y se toma una pequeña porción a diferentes tiempos(5, 10, 15, 30) para ser sometida al espectrofotómetro después de agregarle 3mL de la solución de sustratos en una celda; se mide cada...