western blot

López Carrillo Dulce Daniela
WESTERN BLOT
Esta técnica descrita por por Towbin et al. en 1979 emplea la transferencia de macromoléculas, en este caso anticuerpos, ubicados dentro de un gel a unamembrana exponiéndolas en su superficie para localizar antígenos específicos, adhiriéndose a éste por medio de una enzima a la cual se le agrega un sustrato, puede ser un quimiluminiscente, para poderver el objetivo, correlacionando la intensidad de la señal con la cantidad de antígeno.
Hay dos métodos para la detección del antígeno, el directo, donde el anticuerpo empleado ya va marcado o elindirecto, en el cual se emplea un segundo anticuerpo marcado que se adhiere al primero el cual no iba marcado. Este último método es el más empleado.
Antes de realizar el western blot, oinmunoblotting propiamente dicho es necesario que después de la separación de las macromoléculas en el gel sean transferidas dichas proteínas correctamente a la membrana siendo la transferencia electroforética elmás usado por medio del cual se juntan el gel y la membrana dejando en medio las proteínas que migran por efecto de un campo eléctrico. A manera de asegurar la correcta unión se tiñe la membranausualmente con rojo Ponceau. Es necesario bloquear aquellos sitios de unión de la membrana sin reaccionar con los antígenos para evitar uniones inespecíficas, cada tampón varía según el anticuerpo yantígeno.
La selección de anticuerpos va en función de lo que se desee, pudiendo ser monoclonales o poloclonales, esto y el tipo de marcaje (biotina, fluoróforo o enzima) que se desee definirán la eleccióndel segundo anticuerpo. Por su parte el tipo de marcaje y el tipo de señal que se quiera determinaran el sustrato necesario, como las más usadas son las enzimas (AP y HRP) se utilizan sustratoscromogénicos, siendo los más usados el TMB, el 4-CN y el DAB que dan una coloración azulada. Otro sustrato utilizado últimamente es el quimioluminiscente del cual el más empleado es el luminol. La...