salting out

protocolo de extracción de dna por salting-out para pequeños volúmenes de sangre
A modified salting-out protocol for DNA extraction from small blood sample volumes
Riera Mario A., Rojas Maria E., Zapata Pedro D.
Resumen
Se desarrolló un protocolo modificado de extracción de DNA por salting-out a partir de muestras de sangre con volúmenes decrecientes (300; 100; 50; 25; 10; 5; 2,5; 1 y 0,5µL). Se llevó a cabo posteriormente una amplificación de un fragmento de 345 pb del gen de la protrombina y de un marcador STR (short tandem repeat) utilizado comúnmente para estudios de filiación, mediante la reacción en cadena de la polimerasa, visualizándose los amplicones en un gel de poliacrilamida al 6,4 %. En todos los casos, la reacción de amplificación fue exitosa, demostrando así que elprotocolo de extracción desarrollado permite obtener DNA en condiciones de pureza y cantidad suficiente a partir de pequeños volúmenes de sangre. De este modo, puede disminuirse la cantidad de muestra necesaria para realizar un estudio molecular, lo cual es fundamental en áreas como la genética forense donde la cantidad de muestra disponible puede ser limitada.
Palabras clave: Muestras de sangre;Extracción DNA; salting-out; PCR.
Abstract
A modified salting-out procedure for DNA extraction from decremental blood sample volumes was developed (300; 100; 50; 25; 10; 5; 2,5; 1 and 0,5 µL). A 345 bp human prothrombin gene fragment and a STR marker commonly used for filiation analyses (LPL) were then amplified by Polymerase Chain Reaction and visualized in a 6.4 % polyacrylamide gel. In all casesthe amplification reaction was successful, showing that the DNA extraction method proposed here yields DNA of reasonable purity and quantity from small blood sample volumes. Therefore, the quantity of sample needed to perform a molecular study can be reduced, which is fundamental in certain areas such as forensic genetics, where the quantity of samples available could be limited.
Key words:Blood sample; DNA extraction; salting-out; PCR.

Introducción
La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa de todo análisis genético. Obtener DNA relativamente puro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que será destinado, en el marco de investigaciones de tipo forense, poblacionales, predisposición a enfermedades yotros. Esta tarea demanda una “puesta a punto” de las técnicas de extracción utilizadas, con el objeto de determinar las condiciones ideales en las que se obtendrá un máximo rendimiento. En general; los métodos de extracción de DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de lasmembranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto),
Rev. Cienc. Tecnol. / Año 12 / Nº 14 / 2010 concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibirla Taq polimerasa) y resuspensión. [1, 2]
Riera Mario A. et al.: Extracción de DNA para pequeños volúmenes de sangre 5

Para muestras de sangre en particular, distintos protocolos han sido descriptos y publicados, pudiendo diferenciarse básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del extracto [3, 4]. Así podemos encontrarmétodos que aprovechan las propiedades desnaturalizantes que tienen ciertos solventes orgánicos como cloroformo, fenol, etc. [1, 3], y a aquellos fundamentados en el conocido cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio [1, 5]. Así, en presencia de bajas concentraciones de sales, se verifica un ligero aumento en la...