Protocolo De La Técnica De Western Blot

Protocolo Western Blot

Extracción de proteínas
1. Centrifugar células a 2500rpm por 3 minutos a temperatura ambiente
2. Retirar sobrenadante
3. Resuspender 250 µL de buffer“RIPA+IP+IF” por cada 4 millones de células
4. Vortex ligero cada 10 minutos(mantener en hielo)
5. Centrifugar 14,000rpm por 30 minutos a 4°C
6. Guardar sobrenadante a -20°C(Proteínas establesaproximadamente 2 meses)

Cuantificación de proteínas BCA® Protein Assay Kit
1. Para preparar 2 muestras
a. 196 µL de Reactivo A x 2 = 392 µL
b. 4 µL de Reactivo B x 2= 8 µL
2.Preparar caja de 196 pozos de fondo plano
c. En el pozo blanco agregar: 25 µL de H2O + 200 µL de Reactivos(A+B)
d. En el pozo muestra agregar: 5 µL de Proteína + 20 µL de H2O + 200 µL deReactivos (A+B)
3. Incubar por 30 minutos a 37 °C
4. Cuantificar en Lector de Elisa a 590nm o lo más cercano (540nm)
5. Introducir resultado a la formula de curva estándar (((614.16 x(X)-25.629) x 5)/1000) obteniendo como resultado µg/µL

DIA 1

Preparación del gel
El gel para western Blot consta de 2 fases la “Resolutiva” y la “Concentradora”

Gel 10%
Gel resolutivo | Gelconcentrador |
Buffer resolutivo 1.8 ml H2O 4.2 mlAcrilamida 3 mlTEMED 8 µlAPS140 µl | Buffer concentrador 0.4 ml H2O 3mlAcrilamida0.6 mlTEMED 5µlAPS 80µl |

Gel 15%
Gel resolutivo | Gel concentrador |
Br 1.8 mlH2O 2.7 mlAcrilamida 4.5 mlTEMED 8 µlAPS 140 µl | [M] 0.4 ml H2O...