Practica Cinetica Enzimatica

11/10/2012
11/10/2012

Escuela de Medicina de León
Módulo II
Biología Molecular, Celular y Tisular
Práctica III
Cinética enzimática
Dr. Cortes
Integrantes:
* Edgar Arturo Pérez Du-Pond-155928
* Néstor Alejandro Murillo-339358
* Edith Liliana Ramírez Gutiérrez-341020
* Paulina Origel Martínez-155930

Procedimiento
A) Determinación de la actividad enzimática delAspartato aminotransferasa (AST) en suero
1. Se mezcla el reactivo 1 con el reactivo 2 para obtener el reactivo de trabajo.
2. Se centrifuga la sangre del paciente y se separa el suero del paquete globular cuidadosamente, depositándolo en un tubo eppendorf de 1.5 uL
3. Se ajusta a cero el espectrofotómetro con agua a 340 nm
4. Se coloca en un tubo de ensayo 1 ml de reactivo de trabajocon 100 ul
5. Se toma la primer lectura de la mezcla de la reacción
6. Se incuba durante 3 minutos adicionales, tomando la lectura de absorbancia cada minuto.
7. Se calcula la absorbancia como lo muestra la siguiente manera:
Abs1 – Abs2
Abs2-Abs3
Abs3-Abs4
8. Al final se realiza la suma de las 3 absorbancias obtenidas y se multiplica por el factor 1750 U/L de AST
9. Reportarla actividad de la enzima en U/L

B) Determinación del efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad de la enzima
1. Se preparan diluciones del sustrato 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. 1:16
2. Se determina la actividad de la enzima n suero de la misma forma como en la sección A
3. Elabore la tabla de concentración de sustrato vs. Actividad de la enzima y se
4. Elabora lagráfica de Michaelis Menten y Lineweaver Burk
5. Determine la Vo, Vmax y la Km

C) Determinación del efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima AST
1. Se prepara la misma reacción en 4 tubos de la misma manera que en la sección A, pero esta vez se incubaran los tubos a distintas temperaturas ( 0, TA, 37 y 65 grados centígrados)
2. Determine la actividad de la enzima dela misma manera que en la sección A
3. Elabore la tabla de actividad enzimática, velocidad y Temperatura.
4. Elabore una gráfica donde se observe el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción

Resultados
A)
AST
Tiempo | Absorbancia | Actividad enzimatica |
Inicial | .201 | - |
1 min | .157 | .044 |
2 min | .135 | .022 |
3 min | .140 | .005 |
0.071 |
0.071x 1750 U/L = 124.250 U/L

B)
Actividad Enzimática | 1:1 | 1:2 | 1:4 | 1:6 | 1:8 | 1:16 |
Inicial | .233 | .164 | .245 | .430 | .197 | .168 |
1 minuto | .247 | .157 | .236 | .217 | .168 | .130 |
2 minutos | .236 | .152 | .227 | .307 | .179 | .126 |
3 minutos | .235 | .159 | .221 | .147 | .139 | .146 |
AE | 848.75 | 798 | 768.25 | 421.75 | 505.75 |409.50 |

C) Temperatura ambiente:

Lectura | Actividad Enzimática | Absorbancia |
Inicial | .168 | - |
1 min | .130 | .038 |
2 min | .126 | .088 |
3 min | .146 | .234 |
.360 |
0.360 x 1750 U/L = 630 U/L

37° (36°)

Lectura | Actividad Enzimática | Absorbancia |
Inicial | .216 | - |
1 min | .193 | .023 |
2 min | .211 | .188 |
3 min | .195 | .383 |
.594 |
0.594 x1750 U/L = 1039.50 U/L

65º

Lectura | Actividad Enzimática | Absorbancia |
Inicial | .173 | - |
1 min | .142 | .031 |
2 min | .127 | .096 |
3 min | .113 | .209 |
.336 |
0.336 x 1750 U/L = 588 U/L

0º

Lectura | Actividad Enzimática | Absorbancia |
Inicial | .229 | - |
1 min | .235 | .006 |
2 min | .219 | .225 |
3 min | .200 | .425 |
.656 |

0.656 x 1750 U/L = 1148U/L



Discusión
El efecto enzima-sustrato se pudo corroborar, según la literatura científica, debido a que las tablas realizadas, nos demostraron como, la enzima y su efecto sobre el sustrato se ve afectado, conforme se aumenta el nivel de temperatura y de concentración de sustrato. Por ejemplo, se pudo observar, que tal como se dice en los libros, cuando mayor es la concentración de...