Optimizacion De La Reaccion En Cadena De La Polimerasa (Pcr)

OPTIMIZACION DE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

INTRODUCCIÓN.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica poderosa utilizada para la amplificación de un segmento especifico de una secuencia, ya sea de DNA o RNA, empezando con solo una pequeña cantidad de material, un segmento de DNA puede ser multiplicado más de 1 millón de veces.

Dada su gran sensibilidad,la PCR se ha convertido en una herramienta muy popular con un gran rango de aplicaciones como por ejemplo: se utiliza en la biología molecular para clonación y secuenciación de DNA; en el medio forense se utiliza para identificar a los sospechosos o las victimas por medio de muestras de sangre, semen, saliva o tejido encontrado en una escena del crimen; los genetistas clínicos utilizan la PCR paradeterminar la posibilidad de transmisión o portación de trastornos genéticos.

En sí la PCR es una síntesis de DNA en un tubo, para realizar la amplificación es necesario combinar una serie de sustancias, las cuales se enumeran a continuación:
a) Templado de DNA. El templado es el que lleva el segmento de DNA que se desea amplificar.
b) Primers. Un primer es una pieza de DNA corta y de unasola cadena que se alinea con su secuencia complementaria en el templado. Se utilizan un par de primers para que se unan cada uno con un extremo de la secuencia a amplificar. Estos primers están diseñados para que se alinien en ambas direcciones.
c) DNA polimerasa. Esta es la enzima utilizada para sintetizar nuevas cadenas de DNA. Ésta agrega nucleótidos nuevos al extremo libre del primer, losnucleótidos son complementarios con la cadena molde.
d) Magnesio. La DNA polimerasa requiere magnesio para su actividad. El magnesio es normalmente utilizado como cloruro de magnesio.
e) dNTPs. Son los nucleótidos utilizados para que la DNA polimerasa extienda al primer alineado.
f) Buffer. Se utiliza para asegurar que la DNA polimerasa se encuentre en un ambiente idóneo para su actividad máxima.Aunque la PCR es una herramienta poderosa para la amplificación de secuencias genéticas, no es una ciencia exacta. Aunque se utilice un protocolo establecido que ya haya resultado exitoso en la amplificación de cierto segmento, si éste se utiliza para un segmento diferente, una muestra diferente se debe generar un nuevo protocolo de optimización para que se llegue a una amplificación exitosade un segmento de DNA en particular.





FACTORES A CONSIDERAR DURANTE LA OPTIMIZACION

Existen factores principales que se deben visualizar al momento de optimizar una PCR.
• Cuantas secuencias diferentes de DNA, además de la que me interesa, pueden generar una señal positiva (especificidad).
• Cuantas copias del DNA molde son necesarias para generar una secuencia positiva(sensibilidad).

OPTIMIZACION
El proceso de PCR es ampliamente utilizado en una gran variedad de aplicaciones experimentales para producir una gran variedad de secuencias molde de un DNA específico.

No se pueden establecer un solo set de condiciones para todas las amplificaciones por PCR, hay elementos que deben ajustarse como las concentraciones de los reactivos así como los parámetros de tiempo ytemperatura.

En los párrafos siguientes se desglosaran los parámetros que se optimizan normalmente:

• Concentración de magnesio. Los cambios en la concentración de magnesio puede afectar la temperatura de alineamiento de los primers; así como también la especificidad y la sensibilidad del producto (por la formación de dímeros de primers), y la actividad enzimática. La Taq polimerasanecesita magnesio libre, el cual no esté unido al DNA o dNTPs. La concentración idónea de magnesio para una PCR es de 0.5-3.0 mM.
• Concentración de trifosfato de desoxinucleótidos. La concentración óptima está entre 20 y 200 µM. Los 4 dNTPs deben ser usados a concentraciones equivalentes para minimizar los errores de apareamiento. Si alguno estuviera en una concentración mayor que las otras, será...