Laboratorio de fitomejoramiento

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
ESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

FITOMEJORAMIENTO

TEMA:
EXTRACCION DEL ADN EN PLANTAS

INTRODUCCIÓN

Para la extracción del ADN vegetal es tener en cuenta tres factores:

1. El tipo de planta y de tejido que se va a emplear como fuente. Por ejemplo, los tejidos jóvenes contienen más ADN que los tejidos viejos.Además, es necesario considerar la composición bioquímica de los tejidos. Por ejemplo, el método de extracción del material genético proveniente de tejidos ricos en compuestos fenólicos es diferente al método empleado con tejidos ricos en carbohidratos o aceites.

2. El tipo de ADN que se va a extraer. Las plantas poseen tres tipos de ADN: el nuclear, el mitocondrial y el cloroplástico.Reciben estos nombres dependiendo del tipo de organelo celular en el que el ADN se encuentre. Los distintos tipos de ADN tienen características bioquímicas semejantes. Sin embargo, el tipo de información biológica que codifican es completamente diferente.

3. El tipo de análisis a realizar (RFLP, RAPD, AFLP, secuenciación, etc). Con base en la cantidad y la calidad del ADN se puedendesarrollar diversas técnicas de análisis.

El objetivo principal en un experimento de extracción de ADN es obtener una preparación de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la posibilidad de almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su estructura y propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la reproduciblidad en experimentos posteriores. La cantidad, por suparte, es un concepto relativo que depende, entre otros, del número y estado de las células propias del tejido a estudiar. Por lo tanto, como regla general, un buen método de extracción debe mantener la integridad física y bioquímica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y concentración.

En plantas existen múltiples protocolos para extraer y purificar el ADN. Sin embargo, todos ellosincluyen cuatro pasos indispensables:

1. Ruptura de tejidos y paredes celulares. Este paso consiste en pulverizar el material vegetal a bajas temperaturas, generalmente empleando nitrógeno líquido o hielo seco. También existe la pulverización en seco, un proceso en el cual los tejidos se deshidratan por secado en un horno o con silicagel. Sin embargo, este procedimiento no es de aplicacióngeneral y en palma de aceite, por ejemplo, el tratamiento de secado no permite recuperar ADN de buena calidad. Para degradar paredes celulares se pueden utilizar, además, enzimas tipo celulasas.

2. Ruptura de membranas. Una vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas celulares para liberar el ADN. Esto puede ser llevado a cabo químicamente con detergentes (SDS,Triton o detergentes comerciales). También se emplean métodosfísicos, como aquellos basados en ultrasonido.

3. Inhibición de enzimas que destruyen al ADN.

OBJETIVOS

• Obtener ADN de buena calidad a partir de hojas de papa

MATERIALES Y METODOS
Reactivos

1. Buifer de extracción CTAB 2X

2. Cloroformo: alcohol isoamílico (24:1)

3. Etanol 70% frío

4.Isopropanol frío

Materiales

1. Hojas de plantas de tomate de árbol crecidas in vitro. 200 mg / reacción

2. Tubos eppendorf de 1.5 mIde capacidad

3. Micropipetasde 1-20, 10-100 y 100-1 000 ul de volumen

4. Morteros y pistilo

5. Marcador permanente

6. B-mercaptoetanol

7. Baño María 62° C

8. Microcentrífuga

Procedimiento

1. Tomar 1 o 2 hojas jóvenesde papas.

2. Colocar la(s) hoja(s) en un mortero y agregar 800 ul de buffer de extracción

3. (2X CTAB).

4. Triturar la(s) hoja(s) lo más finamente posible, con el pistilo

5. Transferir el extracto desde el mortero a un tubo eppendorf de 1.5 ml

6. Incubar el tubo en baño Maria a 62° C por 45 minutos a una hora.

7. Agregar 400 ml de la mezcla cloroformo:...