bioquimica

Purification of Papain from Fresh Latex of Carica papaya.
ABSTRACT
In the present study we wish to report a method of crystallizing papain from fresh papaya latex which gave higher yields than previously reported. This method does not involve the use of sulphydryl reagents. The papain thus obtained is practically pure and shows a single band when submitted to electrophoresis on polyacrylamidegel, and is identical to the papain obtained by other methods. In routine enzymatic assays, specific activity was measured using Z-gly-pNP and BAEE as substrates. Papain crystallized by this method, without the use of high concentrations of salts or thiol-containing substances such as cysteine and dithiothreitol, is obtained in the form of a complex with natural inhibitors existent in latex whichcan be removed by dialysis.

Resumen
La papaína presente en el látex de Carica papaya se ha estudiado ampliamente ( Brocklehurst et al., 1981 , Brocklehurst et al., 1987 , apud Thomas 1994 , Mellor et al., 1993 ) y es una enzima de utilización industrial y de alta investigación interés . Entre las principales aplicaciones de la papaína son su uso en la industria alimentaria , ( Neidlema ,1991 ) la clarificación de la cerveza, ( Caygill , 1979 ) de ablandamiento de la carne , la preparación de hidrolizados de proteínas y otros ( Dupaigne , 1973 ) . Bolas et al., 1937 , desarrolló un proceso para la purificación y el aislamiento de la papaína en el estado cristalino nativa a partir de látex fresco. Este método fue posteriormente modificado ( Kimmel y Smith, 1954) utilizando látex secodisponible en el mercado y ha sido el método clásico para la preparación de la papaína durante muchos años , con algunas modificaciones posteriores ( Arnon , 1970 , Baines y Brocklehurst , 1979) . Según Brocklehurst et al., 1981 , Baines y Brocklehurst , 1979 , 1982 , Brocklehurst et al., 1981 , extractos acuosos de Carica papaya látex contener algunos proteinasas de cisteína que pueden serseparados por cromatografía de intercambio iónico , y formas totalmente activos pueden también ser obtenido por cromatografía covalente utilizando el intercambio de tiol - disulfuro ( Brocklehurst et al., 1985 , apud Mellor et al., 1993 ) . La cinética y la ionización del sitio catalítico de la papaína obtenida por diferentes métodos ( Cys - S- / Su Im- formación + H ) son una cuestión de controversia .Estudios llevados a cabo por uno de los principales grupos especializados en la investigación sobre la familia de cisteína - proteinasa a partir del látex de Carica papaya han demostrado la importancia de la utilización de inhibidores reversibles durante su aislamiento y la manipulación ( Brocklehurst et al., 1981 ) . Los autores también hicieron hincapié en que las múltiples ionización ocurrenen quimopapaína y papaína puede ser un fenómeno general para la familia - cisteína proteinasa ( Thomas et al . , 1994) . En el presente estudio se informe sobre el desarrollo de un método para la purificación y cristalización de la papaína nativa a partir de látex fresco ( Monti, 1983 ) , que difiere de los métodos clásicos descritos en la literatura . El método mostró que la papaína precipitaespontáneamente a bajas temperaturas , presentando un alto nivel de pureza y una excelente actividad catalítica en comparación con los métodos clásicos de Kimmel y Smith, 1954 .

Material y Métodos
Preparación del extracto crudo
solation y la cristalización de la papaína . El siguiente procedimiento se utilizó para obtener la papaína en forma cristalina : 1 ) para la preparación del extracto ,el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA ), pH 7,0 , se añadió al látex fresco a una concentración final de 1 mM y la preparación se mantuvo bajo nitrógeno durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación constante. Posible volátil arrastrada por el nitrógeno se recogieron cualitativamente a través de burbujeante agua destilada y se mide por absorbancia en 230 nm . La suspensión se centrifugó...