ensayoo
Páginas: 2 (386 palabras)
Publicado: 25 de abril de 2013
Diferencias entre un protocolo de extracción de ADN para cultivo celular (TECNICA PROBE) y un protocolo para la extracción de ADN de Micrococcus spp.
Cultivo celular
Micrococcus sppExtracción
Adición de lisis de glóbulos rojos (8 mL) y 2 mL de sangre, mezclar.
Centrifugación a 3000 RPM/ 8 minutos.
Se descarta el sobrenadante, el pellete se mezcla con 2.5 mL de buffer de lisiscelular.
Dejar a temperatura ambiente 20 minutos.
Transferencia de 1 mL del cultivo bacteriano a un tubo eppendorf.
Centrifugación a 12000 RPM/ 5 minutos.
Se descarta el sobrenadante y seañade 1 mL de solución de lavado.
Centrifugación a 12000 RPM/ 1 minuto.
Desecha el sobrenadante, utilizar aproximadamente 20 µl de la suspensión.
Adición de 480 µl de EDTA 50 mM; resuspender.Adición de 60 µl de lisozima (10 mg/mL). Mezclar.
Incubación a 37°C/ 1 hora.
Centrifugación a 12000 RPM/ 2 minutos.
Deseche el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl. Resuspender.Adición de 500 µl de solución de lisis. Mezclar.
Incubar a 80ºC por 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Añadir 3 µl de RNasa. Mezclar.
Incubación a 37°C/ 1 hora.
Purificación
Adiciónde 800 µl de solución precipitante de proteínas, mezclar.
Centrifugación a 4000 RPM/ 10 minutos.
Adición de 500 µl de solución precipitante de proteínas de alta concentración salina, mezclar.Incubación en hielo por 5 minutos.
Centrifugar a 14000 RPM/ 10 minutos.
Precipitación
Verter el sobrenadante en un tubo de 15 mL que contiene 2,4 mL de isopropanol frio, mezclar.
Reposodurante 5 minutos. Mezclar hasta precipitar el ADN.
Toma del ADN con una pipeta pasteur.
Centrifugación a 10000 RPM/ 5 minutos.
Lavado con 200 µl etanol al 70%.
Secado a temperaturaambiente.
Resuspender en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 µl.
Transferir 1 mL del sobrenadante a un tubo Eppendorf. Añadir 600 µl de Isopropanol, mezclar.
Centrifugación 14000...
Cultivo celular
Micrococcus sppExtracción
Adición de lisis de glóbulos rojos (8 mL) y 2 mL de sangre, mezclar.
Centrifugación a 3000 RPM/ 8 minutos.
Se descarta el sobrenadante, el pellete se mezcla con 2.5 mL de buffer de lisiscelular.
Dejar a temperatura ambiente 20 minutos.
Transferencia de 1 mL del cultivo bacteriano a un tubo eppendorf.
Centrifugación a 12000 RPM/ 5 minutos.
Se descarta el sobrenadante y seañade 1 mL de solución de lavado.
Centrifugación a 12000 RPM/ 1 minuto.
Desecha el sobrenadante, utilizar aproximadamente 20 µl de la suspensión.
Adición de 480 µl de EDTA 50 mM; resuspender.Adición de 60 µl de lisozima (10 mg/mL). Mezclar.
Incubación a 37°C/ 1 hora.
Centrifugación a 12000 RPM/ 2 minutos.
Deseche el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl. Resuspender.Adición de 500 µl de solución de lisis. Mezclar.
Incubar a 80ºC por 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Añadir 3 µl de RNasa. Mezclar.
Incubación a 37°C/ 1 hora.
Purificación
Adiciónde 800 µl de solución precipitante de proteínas, mezclar.
Centrifugación a 4000 RPM/ 10 minutos.
Adición de 500 µl de solución precipitante de proteínas de alta concentración salina, mezclar.Incubación en hielo por 5 minutos.
Centrifugar a 14000 RPM/ 10 minutos.
Precipitación
Verter el sobrenadante en un tubo de 15 mL que contiene 2,4 mL de isopropanol frio, mezclar.
Reposodurante 5 minutos. Mezclar hasta precipitar el ADN.
Toma del ADN con una pipeta pasteur.
Centrifugación a 10000 RPM/ 5 minutos.
Lavado con 200 µl etanol al 70%.
Secado a temperaturaambiente.
Resuspender en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 µl.
Transferir 1 mL del sobrenadante a un tubo Eppendorf. Añadir 600 µl de Isopropanol, mezclar.
Centrifugación 14000...
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