Biologia Molecular

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA
SP, EN LECHE EN POLVO: OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO EN 12 HORAS

INTEGRANTES :
ORTIZ ACHAYA MADDY
OBREGON LOPEZ MARILYN
ROCA VIDAL CHRISTIAN
UGARTE ANA
QUINO MALENA
RAMOS MENDOZA MIRIAM

SALMONELLA
 Patógenos primarios.
 Reservorio:
Animales. Causan gastroenteritis
(formas sistémicas).
Hombre. Causan fiebres tifoparatíficasCLASIFICACIÓN
Familia Enterobacteriaceae.
Género Salmonella:
 Salmonella enterica.
 Salmonella bongori.

ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
 Antígeno O (LPS):
 Mayores (de grupo).
 Menores.
 Antígeno H (flagelar).
 Antígeno Vi (capsular).

GÉNERO SALMONELLA
SEROGRUPOS

 Grupo B: 4 S. typhimurium
S. paratyphi B
 Grupo D: 9 S. entertidis
S. typhi

 Grupo C: 6 S. virchow
 Grupo A: 2 S. parathyhi APATOGENIA
SALMONELAS GASTROENTÉRICAS

 Puerta de entrada: vía oral.
 Invasión y multiplicación (intestino
delgado).
 Muerte celular y extensión a células
adyacentes/tejido linfoide.

SALMONELAS TIFO-PARATÍFICAS
 Puerta de entrada: vía oral.
 Colonizan mucosa intestinal.
 Invasión y multiplicación. No causan lesiones
importantes.
 Linfáticos locales (placas de Peyer). Sangre.
 Fagocitadaspor macrófagos. Se localizan en
hígado, bazo, médula ósea. Vesícula biliar, intestino.
 Eliminación: vía fecal.

FACTORES DE VIRULENCIA
 Fimbrias .
 Sistemas de secreción tipo III:

 SPI-1: invasión.
 SPI-2: supervivencia en interior
macrófago.
 Cápsula (Ag Vi)

 Evaden fagocitosis.
 Dificulta el depósito de Complemento.
 Enmascaran Ag O.
 Lípido A, toxinas .
 Supervivenciaintracelular.

GÉNERO SALMONELLA
FACTORES PREDISPONENTES
 Edad.
 Gástrico:
 Hipocloridia, tránsito rápido.
 Intestinal:
 Tratamiento antimicrobiano.
 Diverticulosis, fístulas, estenosis.
 Sistema inmunológico:
 Desnutrición, diabetes, neoplasias, SIDA.

METODO DE DIAGNOSTICO POR PCR
 El uso de biochips y de enzimas de restricción, entre otras, ha
facilitado el diagnóstico microbiológico molecularde
patógenos en alimentos.
 El diagnóstico de Salmonella sp., mediante la evaluación de
la selectividad de los oligonucleótidos después de una etapa
previa de enriquecimiento de la muestra, demostrando una
alta probabilidad de detectar un bajo número de células
 Con el concepto de selectividad se incluyen los términos
exclusividad e inclusividad

MATERIALES Y MÉTODOS
MICROORGANISMOS EMPLEADOS YCONDICIONES
DE CRECIMIENTO

 Las cepas de Salmonell
 cultivadas en caldo cerebro corazón
 A temperatura de 37°C

DESARROLLO DE LA PCR
a amplificar el gen invA
efecto de la temperatura de hibridizadón de los oligonucleótidos
el análisis estadístico de los resultados se realizó mediante el
programa Statgraphics Plus versión 5.1
un termociclador PTC-100

 Desnaturalización Inicial De 2' A 95°C
Seguidos de 30 ciclos compuestos por V a 95X,
V a 59.9°C
V a 7TQ
 Extensión de 5'a72°C
 Bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 Mg/ mL
 el ADN obtenidos de cultivos puros de Salmonella typhi, Salmonella paratyphi
y Salmonella typhimurium
 Se realiza la técnica de PCR (EXCLUSIVIDAD)
 El límite de detección fue determinado realizando diluciones de ADN de
Salmonella typhi. en cultivospuros en el rango comprendido desde 1 ng
hasta 1 f

 Contaminación artificial de las muestras y determinación del límite de detección

 Contaminación artificial de las muestras y determinación del límite de
detección

 Extracción de ADN de la leche en polvo contaminada artificialmente

 Reproducibilidad de la PCR

RESULTADOS DEL PCR
Desarrollo de la PCR
criterio de valoración: O, noamplifica
1, presencia de bandas tenues
1, bandas intensas

En la Figura 1 se grafican las
medias muéstrales de la
temperatura de hibridizadón con
intervalos de confianza al 95%,
demostrando que a 59.9"C se
obtuvo la media más alta de
amplificación, cuyo valor decrece
conforme disminuye la
temperatura.

La Figura 2 indica que no se
presentó amplificación a 0.5
mM; la mayor media de
amplificación fue a...